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    分子克隆實(shí)驗(yàn)---第三章:測(cè)序結(jié)果解讀

    發(fā)布時(shí)間: 2025-03-31  點(diǎn)擊次數(shù): 68次

    一代測(cè)序是克隆實(shí)驗(yàn)中常見的下游實(shí)驗(yàn)。現(xiàn)代 DNA 測(cè)序技術(shù)源于 Sanger 鏈末端終止測(cè)序法,其工作原理與 Sanger 測(cè)序不同的是 4 組反應(yīng)的雙脫氧核苷酸分別用不同的熒光分子標(biāo)記,每個(gè)試管的產(chǎn)物在光激發(fā)下發(fā)出不同顏色的熒光,延伸反應(yīng)和鏈終止完成后,將全部 4 組反應(yīng)物混合,在同一泳道進(jìn)行凝膠電泳,通過(guò)激光束激發(fā)熒光分析不同位置堿基的熒光顏色完成測(cè)序分析。


    一般情況下,測(cè)序信號(hào)文件多為 *.ab1 文件,該文件能夠得到每個(gè)堿基的測(cè)序峰型及整體質(zhì)量;*.seq 文件則為 ab1 文件導(dǎo)出得到的測(cè)序結(jié)果序列,ab1 文件中已具有堿基序列信息,因此 *.seq 文件可不作重點(diǎn)關(guān)注。


    一代測(cè)序的每次測(cè)序反應(yīng)能夠產(chǎn)生約 600-900bp 堿基信息,測(cè)序開始的 5 端約 50bp 左右的測(cè)序信號(hào)不穩(wěn)定,檢測(cè) 800bp 左右之后信號(hào)開始衰減,各種波之間有重疊等情況。這部分結(jié)果信息不準(zhǔn)確,不建議參考使用。

    理想狀態(tài)的測(cè)序信號(hào)應(yīng)當(dāng)是獨(dú)立單一的峰形信號(hào),波峰與波谷清晰,峰與峰之間的距離均勻,波峰底部沒有雜峰干擾,此時(shí)得到的堿基信息可信度超高;測(cè)序信號(hào)出現(xiàn)雙峰、套峰等情況時(shí),該處堿基信息可信度低,需要其他測(cè)序結(jié)果共同比對(duì)分析



           

    測(cè)序問(wèn)題的主要原因:
    ◆ 套峰
    a) 全雙峰:多引物結(jié)合位點(diǎn)(菌液、質(zhì)粒);非特異擴(kuò)增(PCR 產(chǎn)物);
    b) 前雙峰:多引物結(jié)合位點(diǎn),其中一套模板測(cè)序中斷(菌液、質(zhì)粒);多引物結(jié)合位點(diǎn)(PCR
    擴(kuò)增未純化產(chǎn)物);引物二聚體或小片段干擾(PCR 產(chǎn)物純化非切膠樣品);
    c) 中間雙峰:非單克?。ň骸①|(zhì)粒);堿基缺失或等位基因雙模板(PCR 擴(kuò)增未純化產(chǎn)物);
    d) 后雙峰:非單克隆(菌液、質(zhì)粒);堿基缺失(PCR 產(chǎn)物)。


    ◆ 測(cè)序信號(hào)

    a) 無(wú)信號(hào):引物結(jié)合位點(diǎn)不存在或被破壞;
    b) 信號(hào)差:引物或模板的質(zhì)量不高,或引物和模板匹配性低,或樣本濃度偏低;
    c) 信號(hào)衰減:可能因測(cè)序序列的特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致,如 Poly 結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列、回文結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、GC 富集、AT 富集等;若為正常峰形后逐漸衰減,可能模板反應(yīng)量不足;
    d) 信號(hào)中斷:模板存在高級(jí)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致 dNTP 和 ddNTP 在某位點(diǎn)無(wú)法與模板結(jié)合;
    e) 測(cè)序移碼:測(cè)序開端移碼可能是引物降解,局部移碼可能樣本存在高級(jí)結(jié)構(gòu);

    f) 測(cè)序底峰干擾:可能測(cè)序引物不純;可能測(cè)序樣品不純混有正、反向引物。


    優(yōu)化方案:套峰

    二聚體、小片段干擾:凝膠電泳,切膠純化回收;                                                          
    多引物結(jié)合位點(diǎn):更換引物測(cè)序或反向測(cè)通;
    堿基缺失:構(gòu)建單克隆后測(cè)序;
    非單克隆:在載體構(gòu)建克隆正確下重新挑取單克隆測(cè)序;
    非特異性擴(kuò)增:優(yōu)化反應(yīng)條件重新制備;

    等位基因雙模板:構(gòu)建單克隆后測(cè)序。


    測(cè)序信號(hào)

    無(wú)信號(hào):更換引物或重新提供樣品測(cè)序;
    信號(hào)差:提供高質(zhì)量樣品測(cè)序;
    信號(hào)衰減:特殊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致衰減,建議反向測(cè)序拼接;若正常峰形后逐漸衰減:提供高質(zhì)量樣品;
    測(cè)序中斷:建議反向測(cè)序測(cè)通;
    測(cè)序底峰干擾:重新制備模板,引物 PAGE 膠純化。


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