流式細(xì)胞技術(shù)（Flow Cytometry,簡稱FCM）是一種高效的方法，用于分析和收集細(xì)胞懸液中的單個細(xì)胞。FCM的優(yōu)勢在于其速度快、結(jié)果客觀，并且具有重要的統(tǒng)計意義。它能夠處理復(fù)雜的樣本，同時收集多個參數(shù)，其可靠性和重復(fù)性都非常出色。

今天我將總結(jié)并分享一系列關(guān)于流式細(xì)胞技術(shù)的常見問題及其分析。對于流式細(xì)胞術(shù)的原理和步驟不甚清晰的同學(xué)，建議先閱讀本公眾號以往的文章，了解背景知識。

1.熒光抗體染色無信號或信號弱

（1）加入的抗體量不足：這是普通的一種情況，只需要摸索實驗條件，適當(dāng)增加抗體的量或濃度。

（2）細(xì)胞數(shù)量過多：熒光弱可能是因為細(xì)胞相對于染料太多了，應(yīng)該正確地調(diào)整細(xì)胞的密度，一般低于1*10^7個/ml。

（3）抗體儲存方式不對：抗體沒有保存在4℃并且避光，比如冷凍（-20℃甚至更低）保存可能會導(dǎo)致熒光抗體的沉降，顯著影響抗體染色效果。

（4）用于細(xì)胞內(nèi)染色的熒光染料分子量太大：染料體積太大，因此其進入細(xì)胞的可能性降低。

（5）一抗和二抗不相容：使用的二抗應(yīng)與一抗的物種來源相同（例如，一抗為兔源，則應(yīng)該使用抗兔源二抗）。

（6）儀器問題：（流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由三個部分組成：激光器、濾光片和檢測器。激光器的數(shù)量、檢測器的數(shù)量以及濾光器的類型共同決定儀器的檢測范圍）。這三部分之一出現(xiàn)問題的時候，就無法檢測到熒光信號。

如濾光片選擇有誤：不同熒光有不同的發(fā)射譜，為了檢測到信號，需要搭配能夠捕捉到該波長信號的濾光片（濾光片可以將熒光激發(fā)后產(chǎn)生的相應(yīng)波長的光子引導(dǎo)至特定的傳感器上）；激光器沒有對齊：必要時通過運行液流檢查微珠來調(diào)整路線。

（7）靶蛋白不存在/表達水平低：巧婦難為無米之炊，要給靶蛋白染色，至少要確保組織/細(xì)胞類型表達的靶蛋白至少處于足夠檢測的量。

（8）靶蛋白存在于細(xì)胞表面還是細(xì)胞內(nèi)：有些抗原表達在細(xì)胞表面，有些表達在胞漿、細(xì)胞器內(nèi)、胞核，甚至有些在所有部位都表達。比如對細(xì)胞系進行染色時，胰蛋白酶通常可以引起細(xì)胞表面蛋白的內(nèi)化，因此需要確定好抗原的表達位置，選擇合適的染色方法。

（9）靶蛋白的表達需要經(jīng)過誘導(dǎo)：有些抗原在活化后發(fā)生下調(diào)，而有些蛋白則需要被誘導(dǎo)才能表達。因此要選擇合適的方法激活細(xì)胞，使其充分表達靶蛋白，同時要加蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑使其留在胞內(nèi)，然后固定破膜，染相應(yīng)抗體。

（10）靶蛋白是分泌蛋白：分泌蛋白的檢測十分困難，因為蛋白會在檢測前從細(xì)胞中釋放出來且可能快速降解。高爾基體阻斷劑（如布雷非德菌素A）可用于抑制表達蛋白的分泌，使其仍保留在高爾基體中。然后再用細(xì)胞內(nèi)染色法檢測靶標(biāo)蛋白。

（11）補償過高：使用陽性對照再次正確設(shè)置流式細(xì)胞儀

2.熒光強度過高

（1）抗體濃度過高：這將會導(dǎo)致非常明顯的非特異性結(jié)合或者是特異性結(jié)合的高強度熒光。

（2）過多抗體被捕獲于細(xì)胞內(nèi)：在胞內(nèi)染色的時候，較大的熒光分子被困在細(xì)胞內(nèi)部。

（3）封閉不足：封閉這個操作可以有效地減少染料和蛋白的非特異性結(jié)合。

3.在應(yīng)該只有一個細(xì)胞群的情況下觀察到多個細(xì)胞群

（1）樣品本身含有多個表達靶蛋白的細(xì)胞群：有可能是因為表達該靶蛋白的細(xì)胞群不止一個，但操作過程中沒有做好分離。

（2）出現(xiàn)細(xì)胞雙峰：出現(xiàn)了第一群兩倍熒光強度的第二群細(xì)胞?？赡苁羌?xì)胞分離不充分甚至是細(xì)胞團塊沒有過濾掉，導(dǎo)致檢測時多個細(xì)胞聚集在一起。

4.儀器檢測到的粒子太少

(這里的粒子指的是上樣時儀器檢測到的微粒，有可能是細(xì)胞，也有可能是破碎細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞器，或者沒有充分分離而形成的細(xì)胞團塊）

（1）細(xì)胞密度低：即每毫升樣品的細(xì)胞數(shù)目太少，自然檢測的效率就不高。

（2）檢測的參數(shù)當(dāng)中電壓設(shè)置得太低。

（3）細(xì)胞聚集，堵塞管道：多個細(xì)胞聚集成團快，卻被檢測成一個粒子，且該粒子大小是異常的，在后續(xù)圈門也有可能被廢棄。染色前要輕輕吹打幾次，確保形成單細(xì)胞懸液，上樣之前最好再次混勻。另外，染細(xì)胞死活對于這一問題也有幫助，因為死細(xì)胞會釋放它的DNA，而DNA非常粘稠，最后會導(dǎo)致細(xì)胞成團。

5.背景高或陽性細(xì)胞百分比高

（1）抗體過量。

（2）補償過低：流式細(xì)胞分析中經(jīng)常要用到2種以上的熒光標(biāo)記抗體進行染色，而目前所使用的多種熒光染料發(fā)射譜間有一定重疊，也就是說，熒光A的激發(fā)光會有一部分被熒光B的通道檢測到，這就是熒光溢漏。例如，當(dāng)我們在進行單色流式實驗的時候，可以在其他通道砍到熒光信號，這些熒光信號就是溢漏出來的熒光，而糾正熒光溢漏的過程就是“補償"。補償太低，就無法正確地糾正這些溢漏的熒光信號，使背景變高。

6.側(cè)向散射（反映細(xì)胞的顆粒度）背景高

（1）細(xì)胞裂解過度：制備樣品時離心或振蕩過度，使細(xì)胞破碎產(chǎn)生細(xì)胞碎片。

（2）細(xì)菌污染：從其它微小顆粒和背景信號中區(qū)分細(xì)菌群落的方法是用熒光染料標(biāo)記細(xì)菌，然后使用該熒光來識別目標(biāo)群落。

（3）死細(xì)胞的處理：流式細(xì)胞術(shù)非常容易被死細(xì)胞干擾，因為死細(xì)胞比活細(xì)胞更容易攝取抗體和探針，導(dǎo)致明顯的非特異性染色。且死細(xì)胞的自發(fā)熒光往往特別強，這樣背景熒光變強，就無法觀察到一些靶蛋白的弱陽性表達了。

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