簡介：

首先，如果你已經(jīng)設(shè)計了引物，PCR擴增沒有條帶，請這樣做：

使用第一次的PCR產(chǎn)物作為模版（1~2ul即可），再進行一次PCR。

那你要重新學習PCR擴增了！這篇內(nèi)容，涵蓋了實驗中可能遇到的PCR擴增問題和詳細的解決辦法，主要是如何培養(yǎng)問題解決問題的思考能力，你必須要知道！

PCR擴增主要包括以下幾個組分：1）引物；2）酶；3）dNTP;4)Buffer;5)CDNA或DNA。注：現(xiàn)今大部分PCR酶試劑盒一般都是酶，dNTP和Buffer的預混液。

因此，需要從引物，酶，cDNA和DNA模版下手，進行分析。

一共有以下三步：

第一步，一定要確定的是-cDNA。

每個基因在不同組織，不同時期中表達量是不同的。首先要確定你的基因在哪個組織，哪個時期表達最高，確認之后就選這些組織和時期，否則很難做出來。

問題：怎么查找目的基因在哪個組織和時期中表達高？

答：1）數(shù)據(jù)庫。例如NCBI數(shù)據(jù)庫。

2）文章。查詢你目的基因的別人做過的文章，看看他們使用的什么。

3）新的基因，沒有數(shù)據(jù)庫記載，沒有報道，什么都不知道。使用幾種組織的混合的cDNA.

第二步：檢查你的酶

酶的品質(zhì)（主要是公司的工藝好不好），活性，保質(zhì)期，buffer的凍融程度都會很大程度影響PCR擴增。因此，換一個酶是相對簡單，必須試用的方法。

第三步：最需要實驗經(jīng)驗-引物設(shè)計

解決了酶和cDNA的問題之后，需要進行最復雜的引物設(shè)計。引物設(shè)計是靈活的，根據(jù)目的的不同而不同。qPCR引物設(shè)計因為可以在序列上隨機選擇,因此可以使用引物設(shè)計引物進行設(shè)計，在這里我們主要詳解基因克隆的引物設(shè)計，一般包括CDS的設(shè)計，基因區(qū)的設(shè)計，非編碼區(qū)的設(shè)計等，這些片段的引物設(shè)計一般都固定在一段序列上，不能隨意更改（GC含量，TM值都只能固定在一個相對范圍內(nèi)），因此需要一定的實驗經(jīng)驗和理論基礎(chǔ)，以下為詳細的解決方法。

1.GC含量低于40%或高于60%,長度不在18-25范圍內(nèi)，會出現(xiàn)引物二聚體，設(shè)計的引物不能遵循引物設(shè)計的原則怎么辦？

答：不是所有的引物都必須遵循引物設(shè)計的原則，也不是所有遵循引物設(shè)計設(shè)計原則的都可以擴增出來。例如：GC含量為65%，長度為28，如果實在設(shè)計不了符合原則的，可以以相對符合的設(shè)計方式進行，不必全部符合。

2.設(shè)計了好幾組引物，都不能擴增出來，怎么辦？

酶和cDNA都確定好之后，引物仍然擴不出來條帶，對于不同的目的可以使用不同的方法。

①對于鑒定目的基因，只是想要確定這個基因的序列，可以這樣做：

在引物兩端加一段堿基（5‘的序列可以自己設(shè)計），改變引物的GC含量，TM值等。

②對于僅需要擴增目的基因，不能在5’端添加堿基的情況，且使用F2/R2不能擴增出條帶，可以這樣做：

先在CDS兩端設(shè)計一對引物，先使用F1/R1進行擴增。然后再使用CDS引物F2/R2進行擴增。

③對于表達載體，需要擴增到載體上，可以這樣做：

1）先設(shè)計CDS區(qū)的引物F2/R2擴增，再使用這個PCR產(chǎn)物作為模版，使用帶酶切位點（藍色為酶切位點及保護堿基序列）的引物F1/R1進行擴增。

2）改變所用的酶切位點。

3）換連接方法。如果使用T4連接，可以換成同源重組的方法。

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