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    免疫細胞轉(zhuǎn)染實操時的幾大步驟說明

    發(fā)布時間: 2022-10-09  點擊次數(shù): 1031次
       對于免疫細胞轉(zhuǎn)染實驗,我們拿脂質(zhì)體為例,其作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具,已經(jīng)研究的十分廣泛,中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體,DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細胞。
      具體實操時的步驟如下:
      1.細胞培養(yǎng):取6cm細胞皿,向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養(yǎng)液,37℃二氧化碳培養(yǎng)密度至40%~60%,密度過大,轉(zhuǎn)染后不利篩選細胞。
      2.轉(zhuǎn)染液在EP管中制備(為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量):
      A液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋1ug質(zhì)粒DNA;
      B液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋2ul脂質(zhì)體。
      分別將A液與B液輕彈混勻,靜置5分鐘。
      3.吸取B液加入至A液中,輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。
      4.轉(zhuǎn)染準備:用1mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次,再加入4mL不含血清培養(yǎng)液。
      5.轉(zhuǎn)染:把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,搖勻,37℃恒溫箱置6~24小時,吸除無血清轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
      6.瞬時轉(zhuǎn)染后,可在48-72h細胞長滿之后,提取細胞蛋白或者RNA,驗證敲減/過表達效率。
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