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    細胞培養(yǎng)時如何對器皿進行表面處理?

    發(fā)布時間: 2022-01-05  點擊次數(shù): 2983次

          在實驗室中,我們一般會用聚丙乙烯制成的無菌培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或多孔板來培養(yǎng)細胞。它們透光性好、生長面平滑、能夠提供質(zhì)地均勻、重復(fù)性好的單層培養(yǎng)物。然而由于是人工合成的,因此聚丙乙烯是疏水性的,表面不適宜細胞生長,故用于組織培養(yǎng)的塑料,都要經(jīng)過γ射線照射、化學(xué)處理或電離輻射,以產(chǎn)生親水的帶電表面,使細胞能夠附著。附著遇到的最大困難是如何讓細胞附著上去,而包被附著物有可能會促進細胞的粘附。

          在很多時候,為了適應(yīng)不同實驗的需求、解決細胞貼壁不牢的問題,我們需要對培養(yǎng)器皿用不同的物質(zhì)進行包被后使用。這些物質(zhì)可以是膠原、纖連蛋白或一些其他基質(zhì)產(chǎn)物,尤其在培養(yǎng)原代細胞及3D細胞培養(yǎng)中,運用更為廣泛。



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    聚合物

        科學(xué)家們發(fā)現(xiàn),在缺乏血清條件下,克隆細胞必須以濃度為1mg/ml的多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿,同樣的技術(shù)也可以促進神經(jīng)突觸的生長。其中,多聚-D-賴氨酸(PDL)異構(gòu)體優(yōu)于多聚-L-賴氨酸(PLL),因為前者不容易被細胞外液蛋白酶水解,但目前兩者都在使用。

        Poly-L-lysine的中文名為多聚賴氨酸,簡稱PLL,是通過鏈霉菌屬的細菌菌株自然發(fā)酵生產(chǎn)聚賴氨酸。

    貼壁依賴性細胞,通過包被帶正電的高分子多聚賴氨酸,可以提高無血清或低血清培養(yǎng)環(huán)境下的細胞貼壁率,加強培養(yǎng)器皿表面對血清蛋白和細胞外基質(zhì)蛋白的吸附,加快細胞的增殖。

        多聚賴氨酸(ScienCell,貨號:0403/0413)包被多適用于神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞的培養(yǎng),能夠促進神經(jīng)細胞分化和神經(jīng)突的生長。


    2

    膠原和明膠

        膠原(collagen)是哺乳動物體內(nèi)含量最多的一類蛋白質(zhì),廣泛存在于從低等脊椎動物的體表面到哺乳動物機體的一切組織中。它是支持細胞和組織生長的重要胞外基質(zhì)蛋白,其形成的胞外環(huán)境有利于多種細胞的粘附、生長、遷移和分化。用變性膠原處理后能改善多種細胞的附著能力,如上皮細胞;而天然未變性的膠原可能是細胞分化功能表達所必需的。

        明膠是一種大分子非均質(zhì)親水膠體,是膠原部分水解后得到的水溶性蛋白多聚體,明膠與膠原具有同源性。實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn),包被明膠有利于肌肉細胞和內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)。

        明膠溶液(ScienCell,貨號:0423)與多聚賴氨酸一樣,也是一種粘附劑,涂覆在容器表面可以促進細胞貼壁生長。推薦用于培養(yǎng)分化的人類胚胎干細胞、某些原代細胞和永生化細胞。

        明膠因其具有較高的生物相容性、生物可降解性且體內(nèi)降解后不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物、無免疫原性和血液相容性以及具有與膠原相同的組分和生物性質(zhì),也廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物遞送系統(tǒng)中。


    3

    基質(zhì)成分

        基質(zhì)成分包括層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白等,其中許多是天然產(chǎn)物,如果化學(xué)成分不*明確,則需要一定的純化。當然,細胞外基質(zhì)中的許多成分都可以作為重組蛋白使用,因此成分明確,可以純化。

        纖連蛋白(Fibronectin, FN),也稱為纖維連接蛋白,是一種廣譜的、天然的細胞粘附因子。它主要由肝臟及血管內(nèi)皮細胞生成,廣泛存在于血漿、多種細胞表面及細胞基質(zhì)中,一種高分子量的非膠原性糖蛋白,分子含糖量4.5-9.5%可以與血纖蛋白、肝素、膠原、DNA以及細胞表面受體結(jié)合,而且具有多種細胞生物學(xué)功能,廣泛參與細胞的遷移、粘附、增殖、止血及組織修復(fù)的過程。

        常用于細胞培養(yǎng)的纖連蛋白一般為牛血漿纖維粘連蛋白(ScienCell,貨號:8248)或人纖連蛋白(ScienCell,貨號:8488;中喬新舟,貨號:CSP044)。

        纖連蛋白作為細胞培養(yǎng)的基質(zhì),可提高多種細胞的貼壁率、匯合率,縮短細胞匯合時間,使細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)良好,代謝率增強,DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成速度顯著提高;細胞的集落率升高,原代培養(yǎng)成活率提高。


    4

    細胞外基質(zhì)

        雖然表面有惰性包被已經(jīng)足夠了,但仍然有必要利用合適的單層細胞培養(yǎng)物為某些特殊細胞類型提供合適基質(zhì)。如用去污劑去除匯合的小鼠成纖維細胞(3T3)、人成纖維細胞(MRC-5)等的單層細胞后,殘留的細胞外基質(zhì)(ECM)能促進卵巢顆粒細胞的分化、研究腫瘤細胞行為及血管形態(tài)發(fā)生。


    5

    飼養(yǎng)層

        基質(zhì)覆蓋有助于細胞的附著、生長和分化。但對于一些較難培養(yǎng)的細胞,尤其是低細胞密度下更難培養(yǎng)的細胞,需要活細胞來維持。原因可能是成纖維細胞的代謝物滲漏,或是成纖維細胞分泌生長因子對培養(yǎng)基的補充,也可能由于細胞產(chǎn)物優(yōu)化了細胞的附著面。生長成匯合單層細胞的飼養(yǎng)層可為其他細胞附著提供一個合適的甚至是選擇性的表面。例如,單層神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以促進中樞和外周神經(jīng)元的存活及生長,雖然這種情況是由擴散因子而不是直接的細胞接觸引起的。

        飼養(yǎng)層細胞大部分可用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF),而飼養(yǎng)層細胞大都用于培養(yǎng)胚胎干細胞。


    6

    非黏性附著物

        當然,有時我們不希望細胞附著生長,例如培養(yǎng)非貼壁依賴性的細胞(懸浮細胞)時,可通過將細胞接種到瓊脂中的方法來實現(xiàn),因為在這些基質(zhì)中未轉(zhuǎn)化的細胞不易形成集落。目前最為常用到的是瓊脂、瓊脂糖或Methocel(甲基纖維素)。前兩種為凝膠,第三種為高粘度溶膠。因為甲基纖維素是溶膠,細胞可以在其中緩慢下沉,因此經(jīng)常在其下面放一層瓊脂。在非組織培養(yǎng)基的器皿上不涂瓊脂層也能達到細胞培養(yǎng)的目的,但有時會出現(xiàn)細胞附著和鋪展。



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