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從組織培養(yǎng)細(xì)胞中制備粗微體的方法

發(fā)布時(shí)間： 2021-11-17　　點(diǎn)擊次數(shù)： 975次

材料與儀器
細(xì)胞
環(huán)己酰亞胺勻漿緩沖液
培養(yǎng)皿
步驟
1. 培養(yǎng)基中加入環(huán)己酰亞胺（溶于蒸餾水，貯存液濃度 0.1 mol/L，-20℃ 保存。如果不溶，試著加熱到 40℃ 以幫助溶解）（終濃度 10 μmol/L)，37℃ 保溫 5~10 分鐘。

2. 培養(yǎng)皿從 37℃ 轉(zhuǎn)移到冷室，立即去掉培養(yǎng)基，用含有與培養(yǎng)基同樣環(huán)己酰亞胺濃度的冰冷 PBS 洗滌細(xì)胞 3 次，將培養(yǎng)皿口朝下倒立于紙巾上數(shù)分鐘，偶爾拍打。用 Kimwipe 紙巾擦掉側(cè)壁上殘留的 PBS。

3. 加入 0.7 ml 含有 2~4 單位/ml RNase-IN (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) 的 HM，輕輕混旋培養(yǎng)皿以使 HM，能夠覆蓋培養(yǎng)皿的底面。

勻漿緩沖液（HM）：

10 mmol/L HEPES-KOH 緩沖液，pH 7.5

10 mmol/L KCl

1 mmol/L MgCl2

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L PMSF

4. 將培養(yǎng)皿取一定的角度，在 HM 中打濕橡皮或塑料淀帚，按同一方向?qū)⒓?xì)胞從培養(yǎng)皿的一邊刮到另一邊。

5. 將刮取的細(xì)胞懸浮于 HM 中并集中到培養(yǎng)皿的一邊，打濕細(xì)胞淀帚以同樣的方法刮取培養(yǎng)皿其他部分的細(xì)胞，直到整個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞刮完（細(xì)胞刮走后培養(yǎng)皿的表面變得光滑)。用新鮮 HM 將玻璃吸管內(nèi)表面打濕（見第 4 步），將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)小的緊密配套的 Dounce 勻漿器中（Kontes)。

6. 加 0.7 ml 新鮮 HM 到細(xì)胞已被刮掉的培養(yǎng)皿中，用細(xì)胞淀帚刮洗培養(yǎng)皿底部，將洗滌液轉(zhuǎn)移到另一培養(yǎng)皿中，用同樣的方法刮取細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮液集中到 Dounce 勻漿器中。

7. 當(dāng)兩到三個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸浮液集中到一起以后，照下面的方法勻漿：

(1) 以微小的角度握住 Dounce 勻漿器的管子立在桌子上。

(2) 慢慢將玻璃研杵插入，直到研杵的頭部與細(xì)胞懸浮液表面接觸，沿管子的一邊用力將研杵上下推動(dòng)。

(3) 重復(fù)步驟 (2)，一上一下為一次共進(jìn)行 15~20 次杵擊。

8. 細(xì)胞勻漿后立即用玻璃吸管將勻漿物轉(zhuǎn)移到一個(gè)試管中，并與 1/10 體積的 2.5 mol/L 蔗糖混合。

9. 重復(fù) 3~ 8 步，直到所有培養(yǎng)皿中的細(xì)胞被勻漿。

10. 測(cè)量勻漿物的體積。

11. 在 Sorvall HB-4 轉(zhuǎn)頭（700 g ) 中 2100 r/min 離心 3 分鐘，增加速度到 6500 r/min（7000 g)，再離心 10 分鐘。

12. 轉(zhuǎn)移上清（PMS）到一個(gè)刻度量筒中并加 0.9 體積的 2.5 mol/L 蔗糖以得到終濃度力 1.33 mol/L 的蔗糖-PMS 混合液，或者加 2.2 體積的 2.5 mol/L 蔗糖以得到終濃度為 1.8 mol/L 的蔗糖-PMS 混合液。

13. 在 SW41 轉(zhuǎn)頭離心管中準(zhǔn)備下列分級(jí)梯度（從下到上）：

梯度 a：

1.5 ml 1.8 mol/L 的蔗糖-HM

1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.5 moI/L 蔗糖-HM

5 ml 蔗糖-PMS 混合物

1.5 ml 1.0 mol/L 的蔗糖-HM

1.5 ml 0.6 mol/L 的蔗糖-HM

1 ml 0.25 mol/L 的蔗糖-HM

梯度 b：

5 ml 蔗糖-PMS 混合物

1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.5 mol/L 蔗糖-HM

1.5 ml 含 2~4 單位/ml RNase-IN 的 1.3 mol/L 蔗糖-HM

1.5 ml 1.0 mol/L 的蔗糖-HM

1.5 ml 0.6 mol/L 的蔗糖-HM

1 ml 0.25 mol/L 的蔗糖-HM

14. 在 SW41 轉(zhuǎn)頭中 4℃ 41000 r/min ( 最大 286500 g ) 離心 16 小時(shí)（梯度a ) 或離心至少 5 小時(shí)（梯度b）。

15. 收集在 1.5 mol/L 和 1.8 mol/L 蔗糖層交界面形成的物質(zhì)，這被認(rèn)為是重粗微體部分。

16. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠孟铝蟹椒ㄖ械囊环N濃縮微體

(1) 為了獲得好的多聚核糖體分離圖譜

① 用 0.1% SDS 溶液 100 倍稀釋一部分微體，測(cè)量 260 nm 和 280 nm 的吸收值。

② 估計(jì) 100 μl 微體是否含有足夠多的核糖體來(lái)展示多聚核糖體在蔗糖密度梯度中的分布圖。

③ 用 HM 5 倍稀釋樣品或 7 倍稀釋樣品，并用 SW41 轉(zhuǎn)頭在蔗糖線性密度梯度中進(jìn)行分析。

(2) 為了收集沉淀

① 用 HM 3 倍稀釋樣品或 5 倍稀釋樣品。

② 根據(jù)樣品的體積在 Beckman Ti60 或 Ti50 轉(zhuǎn)頭中 40000 r/min ( 最大 160000 g) 離心 60~80 分鐘。

(3) 為了用于體外翻譯和重建實(shí)驗(yàn)

① 用含 RNase 抑制劑的 HM 3 倍稀釋樣品或 5 倍稀釋樣品。

② 將稀釋的樣品加到 1.8 mol/L 蔗糖墊層溶液上，在 SW41 或 SW60 轉(zhuǎn)頭（轉(zhuǎn)頭的選擇取決于樣品的體積）中 35000 r/min ( 最大 210000 g）離心 60 分鐘。

③ 收集在墊層溶液上部形成的微體膜條帶，如果有必要用 SW60 轉(zhuǎn)頭進(jìn)一步濃縮到較小的體積中。

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從組織培養(yǎng)細(xì)胞中制備粗微體的方法

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