Q：剛收到細(xì)胞，顯微鏡觀察細(xì)胞成片漂浮，該如何處理？

可能是消化過度導(dǎo)致了部分細(xì)胞的細(xì)胞膜受損、凋亡，部分細(xì)胞膜受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢。若細(xì)胞形態(tài)有明顯變化，且細(xì)胞表面有明顯黑點，間隙間也有較多黑點，可能是支原體污染，建議空培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基，觀察黑點是否會增殖。

若還有保種細(xì)胞，請復(fù)蘇靠前代次，并注意觀察拍照，有任何問題可以及時聯(lián)系我司銷售處理售后（需提供細(xì)胞圖片）。

凍管到貨時的剩余干冰情況、收貨后的保存情況、使用的血清、培養(yǎng)基以及復(fù)蘇操作不當(dāng)?shù)仍蚨伎赡苡绊懠?xì)胞復(fù)蘇情況。

貼壁細(xì)胞：

若復(fù)蘇時離心，建議48h后換液，如密度達(dá)到10%，則繼續(xù)按說明書正常操作培養(yǎng)；若復(fù)蘇時沒有離心，建議收集懸浮細(xì)胞后重新接種。若細(xì)胞依然無貼壁增殖，請及時反饋銷售處。

懸浮細(xì)胞：

建議復(fù)蘇48小時后觀察拍照，若培養(yǎng)基沒有變色，部分細(xì)胞仍然比較圓潤，可繼續(xù)放置培養(yǎng)后48小時拍照。若細(xì)胞全部皺縮，請及時聯(lián)系銷售處理售后。

可能原因如下：

1. 沒有及時換液，導(dǎo)致培養(yǎng)基酸度增強、營養(yǎng)成分降低時會出現(xiàn)細(xì)胞胞漿產(chǎn)生及空泡；

2. 沒有及時傳代，細(xì)胞生長過密，少數(shù)細(xì)胞開始在鋪滿的第一層細(xì)胞上生長。很多細(xì)胞開始漂浮時，也有部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性；

3. 若密度很低，則細(xì)胞密度提高會有所改善，可以提高血清濃度或更換質(zhì)量更好的血清。若密度高，請及時更換培養(yǎng)基，注意培養(yǎng)基添加量和換液情況，保證細(xì)胞有足夠營養(yǎng)。

細(xì)胞消化時間一般在2~3min，消化期間請不要晃動培養(yǎng)瓶，部分細(xì)胞需要延長消化時間，或用PBS清洗2次，吸干凈瓶里殘留的PBS后用少量胰酶潤洗，再次添加1ml胰酶進(jìn)行二次消化。

消化時放入培養(yǎng)箱，2~3分鐘后取出，用手掌心拍打瓶尾觀察細(xì)胞脫落情況，如沒有細(xì)胞脫落則繼續(xù)放培養(yǎng)箱。如果消化5分鐘也沒有脫落或只有輕微細(xì)胞脫落，可以繼續(xù)放培養(yǎng)箱，或把消化下來的細(xì)胞收集終止消化后，將培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞繼續(xù)添加1~2ml胰酶繼續(xù)消化。

當(dāng)細(xì)胞有80%左右脫落且成單個細(xì)胞后，可終止消化，用吸管吹打瓶里各部位4~8次，盡量用吸管不用槍頭，不要吹出氣泡，然后收集懸液進(jìn)行離心。

剛收到的細(xì)胞如更換了培養(yǎng)基或血清，會存在變形的情況，屬正常情況，需要一定的適應(yīng)過程。當(dāng)體外培養(yǎng)時間增長后，隨著傳代次數(shù)的增多，細(xì)胞形態(tài)也會有觸角、拉絲、變瘦等變化，可能與消化時間和培養(yǎng)條件有關(guān)。

可能原因如下：

1. 可能是棉球纖維、凋亡細(xì)胞片、血清蛋白，或一些無血清培養(yǎng)基添加因子后的因子析出物，屬于正?，F(xiàn)象；

2. 如果是傳代后細(xì)胞堆積成團(tuán)，肉眼可見白色點狀物，則是消化沒有吹散開或消化過度導(dǎo)致的細(xì)胞抱團(tuán)自救，建議在細(xì)胞密度變高后改善消化過程。

消化過度可能導(dǎo)致部分細(xì)胞的細(xì)胞膜受損、凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢。可以用PBS洗掉凋亡細(xì)胞后，提高一定血清濃度培養(yǎng)，并且改善消化時間。

· 細(xì)菌污染

細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，鏡下可見黑色的到處亂跑的黑點。細(xì)胞一旦出現(xiàn)細(xì)菌污染，爆發(fā)會很快，培養(yǎng)基很快會出現(xiàn)渾濁，且細(xì)胞狀態(tài)明顯變差。

· 真菌污染

一般培養(yǎng)液清亮不變色，鏡下有絲狀物。有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是有很多很多的小塊很清楚，呈珊瑚狀，不像細(xì)胞碎片分不清，慢慢會長出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)。

實驗室較典型的污染真菌是白色念珠菌，它存在于人的口腔和生呼吸道等處。

· 霉菌污染

培養(yǎng)基是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質(zhì)。在37度孵箱中培養(yǎng)2~3天，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見明顯菌絲。長時間后，細(xì)胞雖然仍可生長，但活力狀態(tài)變差。

· 支原體污染

支原體為黑色小點，培養(yǎng)基一般會渾濁。支原體感染細(xì)胞后，細(xì)胞病變不明顯，只是慢慢死亡。