基因克隆在發(fā)明后的 32 年，需求一直不斷增加，但是有些小伙伴的重組質(zhì)粒就是怎么樣都構(gòu)建不出來。其實，看似簡單的傳統(tǒng)基因克隆，可是存在著重重陷阱！美國羅林斯研究中心 （Rollins Research Center）Ichiro Matsumura 在一期的《BioTechniques》上分享了他的經(jīng)驗： “Why Johnny can’t clone: Common pitfalls and not so common solutions."小編今天就把核心的 “姿勢"給大家提煉出來，主要是瓊脂糖凝膠電泳、酶（DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 連接 酶等）和試劑的使用等一些注意事項。

▲從 PCR 產(chǎn)物到質(zhì)粒的工作流程

1.聚合酶 

DNA 聚合酶有兩個對 PCR 過程不可少的附加屬性，但是不利于后續(xù)克隆的步驟。第一， Taq/DNA 混合物的解離常數(shù)在室溫中是 20 nM，與擴增產(chǎn)物的終濃度相當(dāng)，因此酶往往與擴增產(chǎn)物同時純化。實際上，大多數(shù)其他商用 DNA 聚合酶與 DNA 結(jié)合的更加緊密。殘存的聚合酶可以阻止限制性內(nèi)切酶作用于 DNA 末端，或者填補突出的部分。第二，市場上一些改造后的新型 DNA 聚合酶相比于 Taq 酶熱穩(wěn)定性更高，在有機溶劑和離液鹽中的構(gòu)象穩(wěn)定性也更高，PCR 產(chǎn)物的純化更加困難了。

2.割膠回收 

載體經(jīng)過酶切后，需要經(jīng)過凝膠純化提高克隆效率。割膠回收對技術(shù)要求高，也很難自動化， 而且 DNA 暴露在紫外光下會大大降低轉(zhuǎn)化效率。凝膠純化的產(chǎn)量往往有限，因此研究人員需要消化毫克級的 DNA，才能產(chǎn)生最后的終產(chǎn)物。殘留的瓊脂糖或凝膠提取過程中引入的各種溶劑和鹽，可能抑制后續(xù) T4 連接酶的活性，從而降低克隆效率。另外回收效率還與片段的長短相關(guān)，小于 500bp，或者大于 4kb 的片段，加異丙醇有助于提高回收效率。

3.限制性內(nèi)切酶 

限制性內(nèi)切酶的出現(xiàn)是為了保護細(xì)菌免受噬菌體及其他入侵者。因此，限制性內(nèi)切酶/DNA 底物的 KM 值相當(dāng)?shù)停资铣?shù) KM 值等于酶促反應(yīng)速度為最大速度一半時的底物濃度，是酶的特征性常數(shù)之一。KM 值只與酶的結(jié)構(gòu)、酶所催化的底物和反應(yīng)環(huán)境如溫度、PH、 離子強度有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。Km 值愈小，酶與底物的親和力愈大）。所以“提高酶切反 應(yīng)中 DNA 的濃度，這樣凝膠純化的產(chǎn)物才足夠連接反應(yīng)使用"是錯誤的！在這種情況下， 限制性內(nèi)切酶會受到抑制，從而導(dǎo)致不*的消化。

4.T4 連接酶 

連接反應(yīng)失敗的原因有很多，但失敗可能在加入 T4 DNA 連接酶之前就發(fā)生了：由于 DNA 聚合酶擴增不*導(dǎo)致的末端不均一、酶切不*、連接酶抑制劑或者突出的部分被補平。在某些情況下，連接反應(yīng)失敗可能是因為退火效率不夠、反應(yīng)緩沖液中的 ATP 濃度過低（室溫孵育時間過長）或者酶可能變性了。T4 連接酶在室溫下相當(dāng)穩(wěn)定，但如果被水而不是合適的 buffer 稀釋后可不是如此。如果有問題，可以通過陽性對照來檢測酶的完整性：

5.感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化 

在克隆過程中，具有高效轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞至關(guān)重要，這對于之前并不高的分子克隆效率具有一定的補償作用。最常見的兩種轉(zhuǎn)化方法：熱激轉(zhuǎn)化和電穿孔。電穿孔是*的，更重要的是，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的數(shù)量與 DNA 的量成正比，可以達到微克級別，且不會出現(xiàn)熱激中 出現(xiàn)的菌株效應(yīng)或者對質(zhì)粒的長度有限制，所以對于困難的克隆項目，電穿孔無疑是首先選擇的方法。不過雖然熱激轉(zhuǎn)化效率不及電穿孔，而且會因 DNA 過量（>10ng/200μl 感受態(tài)細(xì)胞）而抑制轉(zhuǎn)化，但是它方便??！“冰一冰、熱一熱、涼一涼、加一下再搖一搖"就搞定了，所以還是有很多人使用這個方法的！